نرمال
۵.۳۹۷
C7
۵.۷۵۳
C8
۷.۷۰۷
C9
۱۰.۸۹۶
C10
۱۴.۱۱۱
C11
۱۷.۱۳۱
C12
۱۹.۹۷۱
C13
۲۲.۶۳۰
C14
۵.۱۲۷
C15
۲۷.۴۸۱
C16
۲۹.۷۱۹
C17
۳۱.۸۴۱
C18
۳۳.۸۵۹
C19
۳۵.۷۹۳
C20
۳۷.۶۳۷
C21
۳۹.۴۰۳
C22
۴۱.۰۹۸
C23
۴۲.۷۲۸
C24
۴۴.۲۹۳
C25
۴۵.۸۵۲
C26
۴۷.۶۹۶
C27
۴۹.۹۶۶
C28
۵۲.۴۹
C29
۵۶.۴۸۰
C30
۶۱.۱۴۴
C31

۲-۲ عصاره گیری
۲-۲-۱- مواد و وسایل
۲-۲-۱-۱-گیاه مورد استفاده
برای عصاره گیری ساقه، برگ و میوه گیاه عشقه مورد استفاده قرار گرفت.
۲-۲-۱-۲- مواد مورد استفاده
– سیلیکاژل مصرفی ستون از نوع Kieselgel GF 254 از شرکت Fluka بوده است.
– حلال ها شامل : اتانول، متانول، ، اتیل استات و استون بوده که از شرکت Merck تهیه شده اند.
۲-۲-۱-۳- دستگاه مورد استفاده
– دستگاه تبخیر کن چرخان ۶۱
– سوکسله
۲-۲-۲- بررسی شیمیایی گیاه عشقه
گیاه عشقه از منطقه بندپی بابل جمع آوری و تعیین هویت شد. ۳۰۰ گرم از برگ گیاه را پس ازخشک کردن به صورت پودر شده در یک بشر بزرگ ریخته و دوبار با کلروفرم آن را شستشو داده و سپس به آن اتانول افزوده به طوری که حلال کل گیاه را در بر گیرد، سپس در ظرف را با فویل می پوشانیم. ۷۲ ساعت پس از خیساندن گیاه در حلال، عصاره حاصله را صاف می نماییم و محلول زیر صافی را جدا می کنیم. برای رنگبری محلول از ذغال اکتیو استفاده می کنیم و محلول را به مدت۳ ساعت و حداکثر دمای C˚ ۵۰ روی هیتر قرار می دهیم. پس از آن تحت شرایط خلاء با دستگاه تبخیر کن چرخان حلال پرانی می شود که در انتها شیره غلیظی به دست می آید، بدین ترتیب عصاره خالص مورد نظر جهت اضافه نمودن به ستون کروماتوگرافی آماده می شود [۲۹].
۲-۲-۳- جداسازی مواد تشکیل دهنده ی عصاره
برای جداسازی مواد طبیعی موجود در عصاره که دارای قطبیت متفاوتی می باشند، لازم است که قطبیت حلال شستشو دهنده ی ستون به تدریج افزایش یابد. به همین منظور از حلال هگزان شروع نموده و سپس با افزودن مقادیر مشخصی از اتیل استات، قطبیت حلال افزایش داده شد. بدین ترتیب از عصاره مورد بررسی دو ترکیب جدا کردیم، ولی به علت کافی نبودن غلظت مواد مورد نظر قادر به گرفتن طیفNMR و شناسایی این ترکیبات نبودیم.
۲-۳ بررسی اثرات آنتی باکتریال
۲-۳-۱- مواد و وسایل
۲-۳-۱-۱ گیاه مورد استفاده :
قسمت های مورد بررسی عصاره ساقه، برگ و میوه گیاه عشقه می باشد.
۲-۳-۲-۱- مواد مورد نیاز :
باکتوتریپتون، گلوکز، سدیم کلراید، عصاره مخمر، آب مقطر.
۲-۳-۲-۲- وسایل مورد نیاز :
لوله های در پوش دار مک کارتی، اتوکلاو و انکوباتور

۲-۳-۲- روش کار
۲-۳-۲-۱ تهیه ی محیط کشت LB62 :
محیط کشت LB با ترکیب کردن مقدار g10 باکتوتریپتون، g1 گلوکز، g5 سدیم کلراید و g5 عصاره مخمر در یک لیتر آب مقطر تهیه می شود. بعد از حل شدن مواد در آب، محلول حاصل در لوله های درپوش دار مک کارتی ریخته (در هر لوله ml10) و درب آنها با درپوش مسدود و در اتوکلاو در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵ دقیقه جهت استریل قرار داده می شوند.
۲-۳-۲-۲ باکتری ها و نحوه آماده سازی کشت باکتریایی در LB :
برای هر سری از آزمایشات، باید ۲۴ ساعت قبل از انجام آزمایش، در لوله های محیط کشت LB ، باکتری مورد آزمایش را کشت داده و در انکوباتور در دمای C˚۳۷-۳۵ قرار داده تا حین انجام آزمایش باکتری های زنده و تازه، در دسترس باشند. باکتری های استفاده شده در آزمایش عبارتند از :
۱- اشریشیاکلی
۲- پسودوموناس آئروژینوزا
۳- باسیلوس سوبتیلیس
۴- استافیلو کوکوس آرئوس

۲-۳-۲-۳- بررسی فعالیت ضد باکتریایی عصاره گیاهی به روش حداقل غلظت بازدارندگی رشد باکتری ها(MIC)63 :
برای بررسی فعالیت ضد باکتریایی عصاره سنتز شده از روش استاندارد حداقل غلظت بازدارندگی رشد باکتری ها بر روی باکتری های گرم مثبت و گرم منفی استفاده شد. ابتدا عصاره به لوله های حاوی محیط کشت مایع LB افزوده شد، به طوری که غلظت نهایی هر لوله بین mg/ml 1-300 بود .

شکل ۲-۲ نمایی از لوله های حاوی محیط کشت مایع LB
فعالیت ضدباکتریایی عصاره بردو باکتری گرم مثبت استافیلوکوکوس آرئوس و باسیلوس سوبتلیس و نیز دو باکتری گرم منفی اشراشیاکلی و پسودوموناس آئروژینوزا، ارزیابی شد. به هر لوله حاوی محیط کشت LB و غلظت مناسب عصاره ، مقدار یک درصد (V/V) از کشت باکتریایی مربوطه و استاندارد شده، افزوده شد. این لوله ها در انکوباتور شیکردار ۳۷ درجه سانتیگراد و دور rpm100 گرمخانه گذاری شدند و فعالیت ضدباکتریایی عصاره به صورت حداقل غلظت بازدارندگی رشد هر باکتری (MIC)، پس از ۴۸-۲۴ ساعت گرمخانه گذاری، سنجیده شد. همچنین برای سنجش حداقل غلظت باکتری کشی عصاره (MBC)64، باکتری مورد نظر در لوله های مشابه حاوی محیط کشت LB و غلظت مشخصی از عصاره و دمای آزمایشگاه (C° ۲۵) قرار داده شد. اثر باکتری کشی عصاره در زمان های مختلف ۵، ۱۵، ۳۰، ۶۰ دقیقه و نیز ۲۴ ساعت با روش استاندارد شمارش باکتری های زنده، سنجیده شد.
۲-۴- بررسی فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره
۲-۴-۱- مواد و وسایل
۲-۴-۱-۱ – گیاه مورد استفاده :
قسمت های مورد بررسی عصاره ساقه، برگ و میوه گیاه عشقه می باشد.
۲-۴-۱-۲- مواد مورد نیاز
اتانول، متانول، استات پتاسیم، سدیم کربنات، فروسولفات، فروزین، ۱ ,۱ – دی فنیل – ۲ – پیکریل هیدرازیل۶۵ (DPPH)، BHT، ویتامین C
– موارد مورد استفاده از شرکت Merck و Fluka تهیه شدند.
۲-۴-۱-۳- وسایل مورد نیاز :
اسپکتروفتومتر ماوراء بنفش – مرئیUV-VIS)) شرکت JENWAY – آون – همزن مغناطیسی

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   منابع تحقیق درباره برنامه درسی، دانشجویان، تفکر نقادانه، تفکر انتقادی

۲-۴-۲- ارزیابی میزان توانایی به دام اندازی رادیکال DPPH
یک روش سریع، ساده و ارزان قیمت برای اندازه گیری ظرفیت آنتی اکسیدانی غذاها استفاده از رادیکال آزاد ۱, ۱ – دی فنیل -۲ – پیکریل هیدرازیل (DPPH ) می باشد. این ترکیب یک رادیکال پایدار است که در بررسی خواص آنتی اکسیدانی ترکیبات فعال زیستی جدا شده از عصاره گیاهی به عنوان پذیرنده هیدروژن شناخته شده است. در سالهای اخیراین رادیکال برای بررسی فعالیت آنتی اکسیدانی کمپلکس های زیست شناختی هم به کار رفته است [۳۰]. روش DPPH میتواند برای نمونه های جامد یا مایع استفاده شود و برای ترکیب خاصی به کار نمی رود ، اما کاربرد آنها به طور کلی برای تعیین ظرفیت آنتی اکسیدانی نمونه های مورد آزمایش (عصاره ) است [۳۱]. در این روش از ویتامین C و BHT به عنوان استاندارد های مثبت و از یک نمونه بدون آنتی اکسیدان به عنوان کنترل منفی استفاده شده است. رادیکال DPPH به دلیل داشتن الکترون فرد، به رنگ ارغوانی است و در ۵۱۷ نانومتر جذب دارد. رادیکال DPPH می تواند به طور مستقیم با آنتی اکسیدانها واکنش دهد. زمانی که رادیکال DPPH به وسیله آنتی اکسیدان ها به دام انداخته شود، مولکول پایدار DPPH–H تشکیل می شود که از جذب آن کاسته و به زرد تغییر رنگ می دهد. قدرت آنتی اکسیدان به درصد کاهش رنگ ارغوانی تیره اولیه به رنگ زرد بستگی دارد.

رادیکال DPPH
۲-۴-۲-۱- روش DPPH
در این روش ۸۰ میلی گرم از عصاره گیاه را در اتانول ۹۶ حل کرده و به حجم ۵۰ میلی لیتر می رسانیم. سپس غلظت های متفاوتی از محلول عصاره در اتانول به حجم ۲ میلی لیتر تهیه می کنیم و سپس ۲ میلی لیتر از محلول DPPH ، با غلظت ۱/۰ مولار، به همه ی آنها اضافه می کنیم. بعد از ۳۰ دقیقه جذب نمونه ها در طول موج nm517 به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر UV در مقابل بلانک متانول خوانده شد. ویتامینC و BHT به عنوان استاندارد استفاده شدند و به جهت بررسی بهتر فعالیت آنتی رادیکالی، از فاکتور IC50استفاده شد که بیان گر غلظتی از عصاره است که قادر به کاهش غلظت رادیکال آزاد DPPH به ۵۰ ٪ مقدار اولیه است.
در این آزمایش غلظت های ۸/۰ تا ۶/۱ میلی گرم بر میلی لیتر برای عصاره های مختلف و از هر غلظت سه نمونه تهیه شد. از مقادیر هم حجم حلال (متانول) به همراه DPPH بلانک تهیه شد [۳۲]. در نهایت درصد به دام اندازی رادیکالهای آزاد DPPH با استفاده از فرمول زیر محاسبه می شود:
رابطه ۲- ۲ محاسبه درصد فعالیت آنتی اکسیدانی: (%)I
۰A : جذب بلانک( شاهد(
A : جذب نمونه آزمایشی
۲-۴-۳- ارزیابی محتوای فنولی :
یکی از سریع ترین و ساده ترین روش ها برای تعیین ترکیبات فنولی، روش فولین سیو – کالتو (FCR)66می باشد. ترکیبات فنولی دسته ی مهمی از عوامل آنتی اکسیدانی هستند. ساختار شیمیایی این ترکیب شامل یک گروه هیدروکسیل و یک حلقه بنزنی است و از طریق الکترون جفت نشده در به دام اندازی رادیکال های آزاد نقش دارند. فنول با فرمول مولکولیC6H5OH با نام هیدروکسی بنزن یا کربولیک اسید نیز شناخته می شود. فنول خالص جامد ، سفید رنگ با دمای ذوب C°۴۲ می باشد، به طور معمول قابل انحلال در آب است و خاصیت اسیدی ضعیفی دارد. فنول در بسیاری از صنایع به عنوان ماده اولیه کاربرد دارد، برخی از ترکیباتی که از این ماده تولید می شوند عبارتند از: آسپیرین، پلی اورتان ، بسیاری از رنگ ها ، علف کش ها ، نرم کننده هاو روغن های روان کننده. فنول ها در سبزیجات و میوه های مختلفی چون سیب، هویچ، پرتقال و گوجه فرنگی نقش آنتی اکسیدانی دارند. بلعیدن مقدار زیادی از فنول می تواند باعث سوختگی داخلی و مرگ شود، از طرف دیگر فنول در علم پزشکی به عنوان یک ماده بی هوش کننده و همچنین یک ماده ضدعفونی کننده مورد استفاده قرار می گیرد [۳۳]. جهت ارزیابی محتوای تام فنولی عصاره های اتانولی، متانولی و… گیاه عشقه، از روش فولین سیو- کالتو استفاده می شود.FCR مخلوطی از فسفو مولیبدات و فسفو تنگستات با فرمول شیمیایی زیر است.
۳H2O. P2O5. 13WO3. 5MoO3. 10H2O
۳H2O. P2O5.14WO3.. 4MoO3. 10H2O
اساس این روش اکسایش- احیا است، به این صورت که در محیط قلیایی، اگردر نمونه مورد نظر ترکیبات پلی فنولی وجود داشته باشد، باعث احیا تنگستات و یا مولیبدات در FCR شده و رنگ آبی ظهور پیدا می کند که در nm 760 دارای جذب می باشد.
(phenol-MoW11O40)4- Mo(6) Na2WO4 / Na2MoO4
محیط قلیایی

۲-۴-۳-۱- تعیین محتوای کلی فنولی
محتوای ترکیبات فنولی از طریق روش فولین سیو- کالتو انجام شد. غلظتmg/mL 10 از هر عصاره تهیه شد. سپس ۵/۰ میلی لیتر از هر عصاره با ۵/۲ میلی لیتر واکنشگر فولین سیو- کالتو ۲/ ۰ نرمال مخلوط شد و به مدت ۵ دقیقه هم زده شد. سپس ۲ میلی لیتر از محلول ۵/۷ % سدیم کربنات در آب افزوده شد و جذب پس از ۱۵ دقیقه که نمونه ها را در اتاق تاریک قرار دادیم، به وسیله

دسته‌ها: No category

دیدگاهتان را بنویسید