آن‌‌ها، اختلاف پتانسیل و شدت جریان‌های مختلف، منابع تغذیه ولتاژ تانک‌های مختلف الکتروفورز و تانک‌های مختلف الکتروفروز و هم چنین زمان‌های مختلف الکتروفورز مورد ارزیابی و بررسی قرار گرفتند، که بهترین حالت با ژل آگاروز با غلظت 5/1 درصد حل شده در بافر TBE (5X) و بافر تانک TBE(1X)، اختلاف پتانسیل 80 ولت و به مدت 1 ساعت با دستگاه الکتروفورز شرکتBio Rad حاصل آمد.

3-7-مواد مورد نیاز برای انجام الکتروفورز
3-7-1-ژل آگارز
3-7-1-1-طرز تهیه ژل آگاروز
درصد ژل مورد استفاده در این تحقیق 5/1 درصد بوده با توجه به درصد ژل، میزان پودر آگاروز را محاسبه نموده و پس از وزن کردن، پودر را بسته به نوع تانک (بزرگ و یا کوچک بودن) با میزان مناسب از بافر TBE(1X) در داخل بشر مخلوط کرده و بر حسب نوع استفاده با درصد خاص 5/1 به ترتیب به میزان 5/1گرم از پودر آگاروز با 100سی‌سی بافر(1X) TBE مخلوط گردیده و پس از مخلوط کردن پودر آگاروز در بافر TBE1 X، آن را در مایکروویو قرار داده و پس از شفاف شدن محلول و رسیدن دمای آن به 50-45 درجه سانتیگراد سپس شانه را در داخل آن قرار داده، باید به دقت به داخل قالب ریخته ‌شود و تا سرد شدن کامل ژل صبر نموده تا زمانی که ژل حالت شیری رنگی را پیدا نماید.

3-7-1-2-تهیه بافر الکتروفورز
* محلول EDTA
* Buric acid
* Tris base (TBE-5X)
محلول ذخیره 5 بار غلیظ TBE(5X) به صورت زیر تهیه و در زمان مصرف با آب مقطر رقیق شد. ابتدا 7/3 گرم EDTA را به همراه54 گرم از تریس بیس و 5/ 27 گرم از بوریک اسید را وزن کرده و با آب مقطر به حجم 900 میلی لیتر می‌رسانیم. pH آن را روی 8 تنظیم نموده و به حجم 1000 میلی لیتر رساندیم.
3-7-1-3-بافر سنگین کننده (10x Sample bading Buffer)
این بافر سنگین کننده محلول است تا از درون چاهک ژل خارج نشود و از طرفی می‌توان محل محصولات PCR را بوسیله رنگ بروم فنل بلو که در جلو حرکت می‌کند را مشاهده کرد. 6 میکرولیتر از محصول PCR را با 5/1 میکرولیتر لودینگ بافر مخلوط کرده و به آرامی توسط سمپلر درون چاهک ژل تخلیه گردید.
مارکرمولکلی(DNA Lader )مورد استفاده
مارکر مورد استفاده در این تحقیق 1000 DNA Lader bp ساخت شرکت Viogene با فاصله 100 جفت باز از وزن 100 وزن 3000 جفت باز بود که برای مشخص کردن طیف گسترده‌ای از باندها با اندازه‌های مختلف وزن مولکولی تعبیه شده است.
3-7-1-4-رنگ آمیزی ژل:
رنگ مورد استفاده در این تحقیق اتیدیوم بروماید تهیه شده از شرکت سیناژن بود. مقدار 30 میکرولیتر از رنگ با 300 سی‌سی آب مقطر دو بار تقطیر مخلوط هم زده و ژل الکتروفورز به مدت 20 دقیقه در آن قرار داده تا مراحل رنگ آمیزی انجام شود. رنگ اتیدیوم بروماید سرطانزا بوده و از ریختن آن درکف آزمایشگاه و یا تماس با پوست جداً خودداری گردد. و سپس شستشوی ژل در آب مقطر و سرانجام در دستگاه Gel documentation عمل عکسبرداری از ژل و ذخیره اطلاعات انجام می‌گردید.
این رنگ ساخته شده برای رنگ‌آمیزی ژل‌های متعددی می‌تواند مورد استفاده قرار گیرد و نیازی به تعویض آن در هر بار رنگ‌آمیزی نمی‌باشد. همچنین قبل از قرار دادن ژل در تشتک رنگ‌آمیزی به خوبی آن را به هم زده تا رنگ در تمامی قسمت‌ها پخش گردد و باندها به طور یکسان رنگ‌آمیزی گردند. محل نگهداری رنگ در قسمتی تاریک و دور از نور آفتاب می‌باشد. از ریختن آب گرم بر روی رنگ بعد از تعویض و ریختن آن در سینک ظرفشویی جهت جلوگیری از ایجاد بخارات سمی اکیداً خودداری شود. پس از رنگ‌آمیزی مرحله شستشو در آب مقطر می‌باشد به مدت 10 دقیقه ژل را از رنگ خارج و در آب مقطر جهت شستشو شدن قرار می‌دهیم و پس از گذشتن زمان مذکور آن را بر روی صفحه دستگاه ژل داک قرار داده و از آن عکس گرفته می‌شود. پس از انجام عکسبرداری و ذخیره کردن، ژل با دستکش درون پلاستیک قرار داده شده و در چاه مخصوص انداخته می‌شود.
3-8-توالی‌یابی (sequencing)
پس از اتمام PCR، محصولات PCR در فریزر20- نگهداری گردیدند، سپس به همراه پرایمر به شرکت پیشگام ارسال گردید. محصولات PCR توسط این شرکت برای توالی‌یابی به کشور کره ارسال گردید. علاوه بر این برای اطمینان بیشتر توالی ژن مورد نظر در سایت NCBI بلاست گردید و صحت وجود ژن مورد نظر مورد تایید قرار گرفت.
3-9-1- روش گرد آوری اطلاعات
میدانی: نمونه برداری از نمونه های ادرار مبتلا به عفونت ادراری
کتابخانه ای: انتخاب پرایمرهای مناسب جهت هدف قرار دادن ژن های ویرولانس
آزمایشگاهی: جداسازی ایزوله ها و شناسایی ژن های ویرولانس ابزار گرد آوری اطلاعات
1. بانک های اطلاعاتی مانند اینترنت
2. نشریات معتبر جهت دستیابی به مقالات مرتبط با موضوع
3. جمع آوری نمونه های ادراری به منظور جداسازی اشریشیا کلی

3-9-2- روش تجزیه و تحلیل اطلاعات
1. تکثیر توالی های اختصاصی (ژن های ویرولانس) با استفاده از تکنیک PCR
2. تجزیه و تحلیل باندها (اثر انگشت با استفاده از نرم افزار Image lab
3. بررسی آماری جهت تجزیه و تحلیل داده ها : از نرم افزار SPSS نسخه 18 و همچنین جهت رسم
نمودارها و جداول از نرم افزار Microsoft Office Excel 2013 استفاده شد. مقایسه الگوهای باندی DNA مربوط به ویرولوتایپ ها با رویت و محاسبه نحوه قرارگیری آن ها در ژل بر اساس وزن مولکولی آن ها ومقایسه با مارکر مولکولی و شمارش باندها جهت هر نمونه صورت گرفت. یک ماتریکس صفر و یک به منظور وجود یا عدم وجود باند تهیه و در پایگاه اینترنتی ثبت شد و ویرولوتایپ ها بر پایه مشاهده ی نحوه قرارگیری آن ها در ژل براساس وزن مولکولی آن ها و مقایسه با مار
کر مولکولی و شمارش باندها جهت هر نمونه انجام گرفت. شمارش سویه های واجد ژن ویرولانس و درصد گیری نسبت به کل نمونه ها مبنای درصد شیوع فاکتور ویرولانس می باشد.
فصل چهارم
نتایج و بحث

4-1- فراوانی بیماران بر اساس جنس
در مجموع از کل بیماران که مورد مطالعه قرار گرفتند 18 مورد، 18 درصد مذکر و 82 مورد، 82 درصد مونث بودند.(نمودار 4-1)

نمودار 4-1: فراوانی بیماران بر اساس جنس

بیماران بر اساس سن در 4 گروه سنی(Age) شامل: کودک کمتر از یک سال، نوجوان، جوان و مسن تقسیم بندی گردیدند. 4 مورد(4%) در گروه سنی کمتر از یک سال، 3 مورد (3%) نوجوان، 63 مورد(63%) جوان و 30 مورد(30%) در گروه سنی افراد مسن قرار داشتند.(نمودار4-2)

نمودار4-2: فراوانی بیماران براساس سن(سال)

4-2-نتایج مربوط به فراوانی فاکتورهای حدت در اشرشیا کلی
بررسی های ویرولوتیپینگ ایزوله های اشرشیا کلی که توسط تکنیک PCR انجام گردید نشان داد که 98% از ایزوله ها متعلق به ژن Pap، 95% از ایزوله ها متعلق به ژن aer ، 94% ایزوله ها متعلق به ژن Fim، 86% از ایزوله ها متعلق به ژن cnf ، 63% از ایزوله ها متعلق به ژن Afa ، 62% از ایزوله ها متعلق به ژن hlyA بودند. نمودار(4-3)

نمودار 4-3: نتایج مربوط به فراوانی فاکتورهای حدت در اشرشیا کلی

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   سطح بلوغ

4-3- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن آئروباکتین در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن PCR با کمک پرایمرهای اختصاصی که در فصل سوم ذکر شد انجام گردید.

4-3-1-بهینه سازی دمای اتصال
به منظور انتخاب مناسب ترین دمای اتصال، گرادیانت دمایی مطابق(تصویر 4-1 ) انجام گردید. طبق تصویر باندهای بدست آمده از pcr توسط پرایمر های فوروارد و ریورس دمای بهینه 68 درجه سانتی گراد انتخاب گردید چون وضوح باند در این دما بهتر بود( نمونه مورد نظر شماره 23 انتخاب گردید).

تصویر4-1: دماهای انتخاب شده برای انجام گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای اتصال در یک واکنش pcr برای ژن aer، به ترتیب شماره از چاهک 1 الی 4 عبارتند از 69-68-67-66 درجه سانتی گراد و در سمت چپ مارکر مولکولی bp 1000 می باشد.

4-3-1-1- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها
پس از بهینه نمودن روش کار، آزمایش pcr بر روی سایر نمونه ها ی بالینی صورت گرفت که با توجه به باندهای بدست آمده، تصاویر همه باندها واضح بوده و طبق انتظار محصول pcr ما bp 602 تصویر (4-1-1-)(4-1-2-).

تصویر 4-1-1: نتایج pcr به منظور تکثیر ژن aer در سایر ایزوله های بالینی توسط مارکر مولکولی bp 1000 اعداد بالای چاهکها مربوط به شماره ایزوله ها می باشد.

تصویر شماره 4-1-2-: نتایج PCR بر روی برخی نمونه های بالینی. ردیف های 1 تا 4 نمونه های مثبت واجد ژن آئروباکتین و ردیف های 5 و 6 به ترتیب نمونه کنترل منفی و نمونه فاقد ژن آئروباکتین. ردیف MW مارکر مولکولی 1000 جفت بازی می باشد.

4-3-2- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن سایتوتوکسیک نکروزدهنده در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن PCR با کمک پرایمرهای اختصاصی که در فصل سوم ذکر شد انجام گردید.
4-3-2-1- بهینه سازی دمای اتصال
به منظور انتخاب مناسب ترین دمای اتصال، گرادیانت دمایی مطابق(تصویر 4- 2) انجام گردید. طبق تصویر باندهای بدست آمده از pcr توسط پرایمر های فوروارد و ریورس دمای بهینه 57 درجه سانتی گراد انتخاب گردید چون وضوح باند در این دما بهتر بود( نمونه مورد نظر شماره 5 انتخاب گردید).

تصویر 4-2: دماهای انتخاب شده برای انجام گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای اتصال در یک واکنش pcr برای ژن cnf، به ترتیب شماره از چاهک 1 الی 7 عبارتند از 57-56-55-54-53-52- 51درجه سانتی گراد و در سمت چپ مارکر مولکولی bp 1000 می باشد.
4-3-2-2- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها
پس از بهینه نمودن روش کار، آزمایش pcr بر روی سایر نمونه ها ی بالینی صورت گرفت که با توجه به باندهای بدست آمده، تصاویر همه باندها واضح بوده و طبق انتظار محصول pcr ما bp 693 تصویر (4-2-1).

تصویر شماره 4-2-1: نتایج PCR بر روی برخی نمونه های بالینی. ردیف های C+ و C- به ترتیب کنترل مثبت و منفی، و ردیفهای 1و2،نمونه های منفی فاقد ژن و ردیف 3 نمونه واجد ژن فاکتور نکروز دهنده سایتوتوکسیک. ردیف MW مارکر مولکولی 1000 جفت بازی می باشد.

4-3-3- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن همولیزین در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن PCR با کمک پرایمرهای اختصاصی که در فصل سوم ذکر شد انجام گردید.
4-3-3-1- بهینه سازی دمای اتصال
به منظور انتخاب مناسب ترین دمای اتصال، گرادیانت دمایی مطابق(تصویر 4-3) انجام گردید. طبق تصویر باندهای بدست آمده از pcr توسط پرایمر های فوروارد و ریورس دمای بهینه 62 درجه سانتی گراد انتخاب گردید چون وضوح باند در این دما بهتر بود( نمونه مورد نظر شماره 5 انتخاب گردید).

تصویر شماره4-3: دمای مناسب برای ژن hlya 62 درجه سانتی گراد انتخاب گردید چون وضوح باند در این دما بهتر بود نیازی به انجام گرادیانت دمایی احساس نشد

4-4-4- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن p-فیمبریه در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن PCR با کمک پرایمرهای اختصاصی که در فصل سوم ذکر شد انجام گردید.
4-4-4-1- بهینه سازی دمای اتصال
به منظور انتخاب مناسب ترین دمای اتصال، گرادیانت دمایی مطابق(تصویر 4- 4) انجام گردید. طبق تصویر باندهای بدست آمده از pcr توسط پرایمر های فوروارد و ریورس دمای بهینه 63 درجه سانتی گراد انتخاب گردید چون وضوح باند در این دما بهتر بود( نمونه مورد نظر ش
ماره 2 انتخاب گردید).

تصویر شماره4-4: دماهای انتخاب شده برای انجام گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای اتصال در یک واکنش pcr برای ژن pap، به ترتیب شماره از چاهک 1 الی 7 عبارتند از 69-68-67-66-65-64-64درجه سانتی گراد و در سمت چپ مارکر مولکولی bp 1000 می باشد.
4-4-4-2- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها
پس از بهینه نمودن روش کار، آزمایش pcr بر روی سایر نمونه ها ی بالینی صورت گرفت که با توجه به باندهای بدست آمده، تصاویر همه باندها واضح بوده و طبق انتظار محصول pcr ما bp 328 تصویر (4-4-1-).

تصویر شماره4-4-1: نتایج PCR به منظور تکثیر ژن Pap در برخی ایزوله های بالینی توسط مارکر مولکولی bp 1000، اعداد بالای چاهک ها مربوط به شماره ایزوله ها می باشد.

4-5-5- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن Afa در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن PCR با کمک پرایمرهای اختصاصی که در فصل سوم ذکر شد انجام گردید.
4-5-5-1- بهینه سازی دمای اتصال
به منظور انتخاب مناسب ترین دمای اتصال، گرادیانت دمایی مطابق(تصویر 4- 5) انجام گردید. طبق تصویر باندهای بدست آمده از pcr توسط پرایمر های فوروارد و ریورس دمای بهینه 65 درجه سانتی گراد انتخاب گردید چون وضوح باند در این دما بهتر بود( نمونه مورد نظر شماره 9 انتخاب گردید).

تصویر 4-5: دماهای انتخاب شده برای انجام گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای اتصال در یک واکنش pcr برای ژن Afa، به ترتیب شماره از چاهک 1 الی 6 عبارتند از 69-68-67-66-65-64درجه سانتی گراد و در سمت چپ مارکر مولکولی bp 1000 می باشد.

4-5-5-2- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها
پس از بهینه نمودن روش کار، آزمایش pcr بر روی سایر نمونه ها ی بالینی صورت گرفت که با توجه به باندهای بدست آمده، تصاویر همه باندها واضح بوده و طبق انتظار محصول pcr ما bp 750 تصویر (4-5-1).

تصویر 4-5-1: نتایج PCR به منظور تکثیر ژن Afa در برخی ایزوله های بالینی توسط مارکر مولکولی bp 1000، اعداد بالای چاهک ها مربوط به شماره ایزوله ها می باشد.
4-6-6- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن Fim در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن PCR با کمک پرایمرهای اختصاصی که در فصل سوم ذکر شد انجام گردید.
4-6-6-1- بهینه سازی دمای اتصال
به منظور انتخاب مناسب ترین دمای اتصال، گرادیانت دمایی مطابق(تصویر 4- 6) انجام گردید. طبق تصویر باندهای بدست آمده از pcr توسط پرایمر های فوروارد و ریورس دمای بهینه 59 درجه سانتی گراد انتخاب گردید چون وضوح باند در این دما بهتر بود( نمونه مورد نظر شماره 11 انتخاب گردید).

تصویر 4-6: نتایج PCR به منظور تکثیر ژنFim در برخی ایزوله های بالینی توسط مارکر مولکولی bp 1000، اعداد بالای چاهک ها مربوط به شماره ایزوله ها می باشد.


دیدگاهتان را بنویسید